• 13460316789
资讯列表

western blot五年体会——“穷人的劳斯莱

2020-01-22 21:28:41作者:蒙特卡罗-蒙特卡罗网址-澳门蒙特卡罗官网

  从2005年第一次见到抗体到现在,我已经做western blot实验整整五年了。五年里,太多的磨难,太多的惊喜,太多的感触,太多的代价。现在我做博士后,我指导的学生也能一次就上手,虽然他们也会出错,但我很少责备他们,因为我知道自己的路途也并不顺利,如果过度的责难他们,会让他们失去信心,而且更严重的是会导致他们遮遮掩掩,我从来不怕实验做不出来结果,就怕查不出失败的原因。

  我喜欢western blot技术,甚至偏爱或痴迷。最夸张的时候是一天连跑带转了八张膜,实验最不顺利的那两个月我天天就睡在实验室里,有时候三天三夜不睡觉。我不知道自己借了多少钱从丁香园的二手资源版淘过别人用剩的抗体,至今我穿的最贵的裤子也就80元钱,但花1000元买抗体我从来没有觉得破费。好在我的家人和朋友们理解我,支持我,让我能逐步实现自己的愿望。五年里,从器具,试剂,仪器,甚至如何用滤纸,我都形成了自己独有的体系和诀窍,我的一切东东都有品牌,这些品牌组合起来就是穷人的劳斯莱斯。

  回想过去,内心仍然会浸没到悲凉与辛酸中。最难受的时候是做p21抗体,整整半年,从丁香园淘了五个品牌的抗体,都做不出来。最后逼着导师买cst的抗体,还是不出,那时候正好是2008年雪灾,抗体在公路上走了半个月,我收到抗体是大年初二,兴奋地上样,转膜,还是没有,当时我感觉自己就好像浸没在冰窖里。宿舍里暖气不好,第二天我起床时,房子里的洗脸水都已结冰,和我的心绪一模一样。好在上海吉泰是一级代理,让我投诉,cst美国总部发回来他们的蛋白阳性对照品,再试,p21出来了,技术支持是个印度人,一眼就看出来我没有用超声波裂解。我们实验室没有这个东东,我怎么就想不到问题就出在这呢!从投诉到解决问题又是两个月。因为western,造成我博士延期一年半,害得师弟差点被开除,这也是我主动和导师关系疏远的开始。

  但我还是痴迷western,在我心里,western blot技术本身就是穷人的劳斯莱斯。跑一次胶,我一次可以在两张膜上裁切出13种分子,我想不出还有哪项技术能一次实现如此之多的指标。Western稳定,直观,看着胶片上那粗细浓淡变化的条带,就好像自己置身细胞内部,看着那些分子组合跳舞。我内心里一直非常感激当年馈赠抗体的那位老师,是他让我踏上了信号转导的道路,也是因为western,我一度和他几乎决裂。在做western之前,我看文献几乎只看review,因为我看不懂实验性论文的图片,也正是做western,我才开始真正的踏上科研道路。

  我逐渐能看懂IP,CO-IP,EMSA,CHIP,我有了更多的梦想与愿望。五年中,我最得意的是陪着western blto的发明人乔治斯塔克(George R. Stark)院士去敦煌玩,老头年过70,动过心脏手术不久,仍然坚持赤脚爬上陡峭的鸣沙山。我们登顶歇气时,老头一声不吭地又从山顶一步步走下去,从半山腰挖什么东西,等他再上来,我们才看清楚,他手里拿着两个游客随地扔弃的矿泉水瓶子。老头一直把那两个国货拎到了山下的垃圾箱里。这是老头给我最深刻的记忆,境当谋高远,一个人的精神境界决定了他专业道路的高远。

  从western实验我总结出,实验上根本省不下来钱,一个环节的烂货就会导致全盘失败。对于实验设计而言,也是如此,一个步骤的bug会导致整个实验立题和评估的逻辑混乱。如果要追求性价比,也就是如何发挥穷人的劳斯莱斯的最大收益,那从一开始就要按秋后算账的原则选择试剂,要算总账;如果要让实验顺顺利利,那就得注意每一个环节,步步为营,细节决定成败。到现在,只要抗体work,几乎没有我做不出来的分子,western给了我无穷的自信。

  感谢丁香园信号转导版kaige88版主的厚爱,也感谢读贴的诸位兄弟姐妹的垂青,再次致谢!

  做这个实验的时,我同一批次提取的蛋白,胶跑出的条带都不一致,这是什么原因呢?

  Western Blot 实验时敷牛奶大概多久?一定要过夜吗

  我做WB也不算是新手,自己觉得整个过程也没有什么明显的问题,可是最后发光的时候内参整个是晕开的,分子还连成了一条线,之前没出现过这种情况,所以想请大家帮忙分析下,是胶的问题,蛋白的问题,还是什么别的,谢啦!

  本网站所有注明“来源:丁香园”的文字、图片和音视频资料,版权均属于丁香园所有,非经授权,任何媒体、网站或个人不得转载,授权转载时须注明“来源:丁香园”。本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的,且明确注明来源和作者,不希望被转载的媒体或个人可与我们联系,我们将立即进行删除处理。

  稳定转染——qpcr或Western Blot检测稳定克隆的外源基因表达水平